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作者：李鸿佳, 王淑娟, 李艳丽, 董亮 http://
【摘要】 目的: 研究不同剂量脂多糖（LPS）通过诱导肺泡巨噬细胞（AM）Toll样受体4（TLR4）的高表达, 探讨其对哮喘小鼠肺部炎症的影响。方法: BALB/c小鼠随机分为哮喘模型组（OVA）A, 低剂量LPS处理组（0.1 mg/L LPS+OVA）B, 高剂量LPS处理组（100 mg/L LPS+OVA）C, 对照组（生理盐水）D。用卵白蛋白（OVA）致敏与激发建立小鼠哮喘模型; 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）上清中IL?4、 IL?5、 IL?13和IFN?γ的含量, 实时荧光定量PCR法测定AM的TLR4的表达, 光镜观察肺组织病理变化。结果: 与A组相比较, B组BALF上清中IL?4、 IL?5和IL?13的水平显著增高（P0.05）, 而IFN?γ差异无统计学意义（P0.05）, C组BALF上清中IL?4、 IL?5和IL?13的水平显著降低, IFN?γ显著增高（P0.05）; 与A组相比, B组与C组AM的TLR4mRNA表达均明显增高（P0.05）, 两组间差异无统计学意义; 光镜下, A组支气管黏膜下水肿, 黏液腺增生, 可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润。B组与C组上述情况未见减轻, 并出现肺泡腔及间质充血, 中性粒细胞等大量的炎症细胞浸润, D组管腔内无黏液栓, 气道周围无炎症细胞浸润, 肺泡壁结构完整。结论: 低剂量LPS(0.1 mg/L)诱导哮喘小鼠AM的TLR4高表达, 使肺部炎症加重, 而高剂量LPS(100 mg/L)可能会减轻变态反应症状。 http://
【关键词】 肺泡巨噬细胞; 脂多糖; Toll样受体4; 支气管哮喘 http://
支气管哮喘(简称哮喘)是一种以嗜酸性粒细胞为主的众多炎症细胞和炎症因子参与的慢性气道炎症性疾病［1］, 其发病率呈逐年上升趋势, 室内灰尘, 革兰阴性杆菌的内毒素等在哮喘气道炎症中的作用存在很大的争议。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌的一类重要的病原体微生物成分, 研究发现, LPS浓度可影响Th1/Th2炎症反应。高水平LPS可使具有抗原特异性的Th1反应增强, 低剂量LPS可使Th2敏感性增高, 提示LPS可能在过敏性炎症反应中具有独特的双向作用［2］。TLR4是LPS的主要模式识别受体, TLR4结合LPS等病原体相关分子模式后通过释放细胞因子可促进Th1细胞分化, 从而可能在哮喘免疫和宿主保护中起重要作用, 但目前尚没有足够证据证明TLR4能直接识别Th2型免疫应答。我们试图运用不同剂量LPS干预小鼠哮喘模型, 研究LPS诱导AM表面TLR4激活机制, 探讨TLR4激活在哮喘发病机制中的信号转导途径, 进一步明确其在哮喘小鼠气道炎症加重的机制中的作用。 http://
1 材料和方法 http://
1.1 材料 鸡卵蛋白（OVA, GradeＶ, 纯度＞98%, Sigma）, 超纯脂多糖(ultra?pure LPS, E．coli O111: B4, Sigma), BALB/c小鼠(6～8周龄, 雌性)由山东大学试验动物中心提供, 小鼠IFN?γ和IL?4 ELISA试剂盒购自深圳晶美生物公司, 小鼠IL?5和 IL?13 ELISA试剂盒购自上海西唐生物公司, 总RNA抽提与纯化试剂盒购自Roche公司, SYBR Green Ι购自Roche公司, Spector?Ι型酶标分析仪（美国）。 http://
1.2 方法 http://
1.2.1 动物分组与模型建立 将40只雌性BALB/c小鼠随机分为4组, 每组10只, A组为哮喘组, B组为低剂量LPS处理组（0.1 mg/L LPS+OVA）, C组为高剂量LPS处理组（100 mg/L LPS+OVA）, D组为生理盐水对照组。A组于第1(实验开始当天)、 8 d分别腹腔内注射OVA混悬液每次50 μg, ［OVA/AL(OH)3为10 mg/g］, 第15天将小鼠置于自制的有机玻璃盒中, 给予雾化吸入OVA(10 g/L OVA/PBS), 每天30 min, 连续1周。D组致敏与激发均以生理盐水代替OVA。B组和C组分别在致敏阶段每隔2 d腹腔注射1 mL含0.1、 100 μg E．coli LPS, 激发阶段在每次激发前1 h腹腔注射相同剂量浓度E．coli LPS。各组小鼠在末次激发24 h以后处死。 http://
1.2.2 BALF标本的收集 对小鼠行气管插管, 在左主支气管处结扎左肺, 用3 mL冰磷酸盐缓冲盐水(PBS)分3次灌洗右肺, 回收液体量80%为合格, 约2.5 mL/鼠, 1 000 r/min, 离心10 min, 4℃ 离心, 收取各组细胞上清液, -80℃保存待测。 http://
1.2.3 AM的分离与培养 BALF离心后沉淀用生理盐水3 mL重悬、 再离心, 反复洗涤3次, 然后用RPMI1640培养液（含2 mmol/L谷胺酰氨, 100 mL/L胎牛血清, 100 U/L青霉素, 100 U/L链霉素）4 mL混悬细胞, 于孵箱中37℃、 50 mL/L CO2孵育2 h后, 轻轻吸出上清, 去除非贴壁细胞。用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液重悬, 调整细胞浓度为108/L, 培养24 h, 以Giemsa染色法鉴定AM, 台盼蓝染色检测其活性。 http://
1.2.4 AM总RNA提取及逆转录 按TRIzol一步法RNA提取试剂盒说明书提取RNA。抽提出的RNA经紫外分光光度计测定总RNA浓度, A260/A280为1.9。逆转录条件为42℃ 1 h, 70℃ 10 min, 逆转录为cDNA。 http://
1.2.5 实时荧光定量PCR（Real?time fluorescence quantitative PCR）检测基因表达 目的基因TLR4, F 5′?CAGAACTTCAGTGGCTGGA?3′, R 5′?ATTTTGTCTCCACAGCCACC?3′（180 bp）; 内参照β?actin, F 5′?CCTTCCGTGTTCCTACCCC?3′, R 5′?GCCCAAGATGCCCTTCAGT?3′（131 bp）。实时定量PCR样品反应体系采用SYBR Green Ι, 其最终的反应体系为20 μL, 循环条件为: 92℃ 120 s, 92℃ 5 s, 60℃ 60 s, 40℃ 5 s进行45个循环, 所有循环结束后, 绘制溶解曲线判断扩增产物的特异性。每个样品均设置相应未经逆转录的模板作为阴性对照, 绘制β?actin、 TLR4的荧光曲线和溶解曲线, 并得到各自的荧光域值循环数(Ct值), 计算其均值的比值。 http://
1.2.6 BALF上清中细胞因子的检测 IL?4、 IL?5、 IL?13、 IFN?γ的测定采用小鼠ELISA 检测试剂盒, 按试剂盒说明书进行操作, 根据光密度值（A）计算含量。 http://
1.2.7 肺组织病理学观察 小鼠处死后, 打开胸腔, 切取未行支气管肺泡灌洗的左肺近肺门组织, 40 g/L多聚甲酸溶液固定24 h, 常规石蜡包埋, 苏木素伊红（HE）染色, 在扩大400倍的显微镜下观察小鼠肺组织和黏膜上皮的炎症浸润情况。 http://
1.2.8 统计学分析 检测结果均以x±s表示, 采用SPSS13.0统计软件处理。多组间比较采用单因素方差分析, 两组间比较采用NK检验, P0.05为差异有统计学意义。 http:// |
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发表于 2018-8-7 09:01:19