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近年来随着药物溶栓冠状动脉介入术、冠状动脉旁路移植术等治疗方法的临床应用，使受损心肌得到及时再灌注，明显降低了急性心肌梗死的病死率。但缺血的心肌再灌注时也引起一系列心脏与血管的不良事件[1]，有研究显示，促红细胞生成素（rhEPO）可能发挥潜在的抗心肌细胞凋亡和促进血管新生等作用，从而发挥对缺血再灌注心肌的保护作用。但由于促红细胞生成素同时具有促血小板聚集血栓形成的风险[2]，难以应用于临床。在对促红细胞生成素三级结构研究中发现，促红细胞生成素类似结构、促红细胞生成素B螺旋结构表面缩氨酸（pHBP）是红细胞生成素三级机构中的部分区域结构，分子量为1257，无促血小板聚集作用，保留组织保护结构区域，与组织保护的受体相结合[3-6]。本实验拟探讨pHBP在心肌缺血损伤中是否具有心脏保护作用及可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
取10周左右雄性SD大鼠80只，体重（20020）g，由南昌大学动物实验中心提供。乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）检测试剂盒购自武汉亚法生物制品有限公司，重组人红细胞注射液购自沈阳三生有限制药公司，兔抗p44/42 MAPK、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自美国Santa生物公司。pHBP由Araim Pharmaceutical购得。
1.2动物分组及模型建立
参考赵秀梅等[7]的垫扎球囊法制作大鼠缺血再灌注（I/R）模型，实验动物分为4组。假手术组（n=20），丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水；I/R组（n=20），建立动物模型后5 min后通过尾静脉接受静脉注射注射生理盐水1 mL/kg；I/R+pHBP组（n=20），建立动物模型后5 min后通过尾静脉接受静脉注射pHBP 1 g/kg；I/R+rhEPO组（n=20），建立动物模型后5 min后通过尾静脉接受静脉注射注射rhEPO 3000 U/kg[8]。
1.3 生化指标检测
I/R 120 min后自腹主动脉取血6 mL，静置30 min，4℃下，以离心半径5 cm，3000 r/min离心10 min，分离血清。按照试剂盒说明采用化学比色法测定血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量。
1.4 心肌梗死面积测定
存活大鼠在制模24 h后处死，取新鲜大鼠心脏，用PBS缓冲液冲洗，滤纸吸干，-20℃冰冻30 min 后将其横断面切成1～2 mm切片，1% TTC 37℃染色25 min，切片放4%甲醛中过夜以增强颜色对比，非心肌梗死区染色为红色，梗死区不染色。扫描仪扫描心脏切片，使用image proplus 6.0软件测量相关区域面积，梗死面积（%）=左心室组织切片梗死区面积/左心室组织切片总面积100%。
1.5 Western blot法检测p44/42蛋白表达
手术处理后的存活大鼠在制模后3、24 h进行处死。可以通过组织颜色改变鉴别心肌缺血组织和正常组织，进行组织切片放入液氮冷冻心肌梗死组织标本将通过Western blot方法测定p44/42 MAPK，分别取各组心肌组织，提取总[(www. ) 专业提供论文代写和发表的服务,欢迎光临]蛋白，收集上清液，考马斯亮蓝法进行担保定量。SDS-PAGE分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，TBST常温下封闭过夜后，分别加入anti-NF-B小鼠单抗（一抗）、室温下免疫沉淀1 h，加入加入辣根酶标记兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，显色。具体实验方法参照文献[9]，实验胶片扫描后用Image J软件进行图像分析，以-actin（1∶1000稀释）作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量，用Gel-ProAnalyzer分析软件分析通道蛋白的灰度值。
1.6 统计学方法
采用SPSS 15.0 统计软件处理。正态分布计量资料以均数标准差（xs）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用2检验。以P 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组心肌LDH、CK-MB水平的比较
与假手术组比较，I/R组LDH、CK-MB含量明显增加，差异有统计学意义（P 0.05）。I/R+rhEPO组、I/R+pHBP组LDH、CK-MB含量减少，两组差异无统计学意义（P 0.05）；与I/R组比较，差异均有统计学意义（P 0.05），提示pHBP组具有与rhEPO组相似的心肌保护作用。见表1。
表1 各组乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶水平（U/L，xs）
注：与假手术组比较，*P 0.05；与I/R组，#P 0.05；I/R：缺血再灌注；rhEPO促红细胞生成素；pHBP：促红细胞生成素类似结构；LDH：乳酸脱氢酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶
2.2 各组心肌梗死面积情况
假手术组的心肌梗死面积为0.00%，I/R组梗死面积为（18.451.24）%，I/R+rhEPO组梗死面积为（12.321.27）%，I/R+pHBP组梗死面积为（11.642.32）%。与I/R组比较，I/R+rhEPO组和I/R+pHBP组心肌梗死面积均下降，差异均有统计学意义（P 0.05）；I/R+rhEPO组与I/R+pHBP组比较，差异无统计学意义（P 0.05）。
2.3 各组心肌组织p44/42 MAPK蛋白表达
Western blot 法检测各组p44/42 MAPK蛋白水平，与I/R组比较，制模3 h I/R+pHBP组心肌梗死组织p44/42 MAPK蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P 0.05）；I/R+rhEPO组p44/42 MAPK蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P 0.05）。与I/R组比较，制模24 h I/R+rhEPO组心肌梗死组织p44/42 MAPK蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P 0.05），I/R+pHBP组p44/42 MAPK蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P 0.05）。见表2。
表2 各组p[(www. ) 专业提供论文代写和发表的服务,欢迎光临]44/42 MAPK蛋白表达（ng/L，xs）
注：与假手术组比较，*P 0.05；与I/R组比较，#P 0.05；I/R：缺血再灌注；rhEPO促红细胞生成素；pHBP：促红细胞生成素类似结构；p44/42 MAPK：蛋白激酶丝氨酸/苏氨酸激酶
3 讨论
心肌细胞凋亡在持续缺血或再灌注期间均可出现，且与缺血程度、缺血时间长短等有关。心肌细胞凋亡在缺血再灌注损伤中所起作用越来越引起人们的重视，但确切机制还不清楚，可能与细胞在受到刺激后产生大量氧自由基、细胞内钙超载、线粒体损伤、炎症细胞浸润和基因调控等有关[10-12]。
缺血再灌注损伤引起的心肌细胞死亡有两种机制，即坏死和凋亡，并且凋亡是引起心血管系统疾病的重要原因心肌再灌注虽然恢复 |
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发表于 2018-8-18 21:47:29